Aos 18 anos, um pequeno papel em Les Favoris de la lune de Otar Iosseliani despertou em Mathieu Amalric um interesse pelos bastidores do cinema, o que o levou, numa fase inicial da sua carreira, a desempenhar funções técnicas (assistente de realização, direcção de cena,…) em filmes de Louis Malle, Danièle Dubroux, Peter Handke, Alain Tanner, ou João César Monteiro. Realiza a sua primeira curta-metragem nos anos 80, Marre de café, e de seguida Sans Rires (1991), que apresentou no Festival Premiers Plans d’Angers, onde encontra Arnaud Desplechin, que lhe ofereceu, anos mais tarde, um papel em Comment je me suis disputé… (ma vie sexuelle), que lhe valeu o César de Melhor Actor Revelação em 1997. No mesmo ano, realiza a sua primeira longa-metragem, Mange ta soupe, “uma das maiores surpresas do ano” para Jean-Luc Godard. Em 2004, volta a trabalhar com Arnaud Desplechin, no filme Rois et Reine, pelo qual recebeu o César de Melhor Actor. Habitué em filmes de cineastas como Alain Resnais, Otar Iosseliani ou Arnaud Desplechin, no versátil e extenso currículo de actor de Mathieu Amalric constam títulos como Genealogias de um Crime de Raúl Ruiz, Três Pontes Sobre o Rio de Jean-Claude Biette, Munique de Steven Spielberg, Marie Antoinette de Sofia Coppola, O Escafandro e a Borboleta de Julian Schnabel, 007 - Quantum of Solace de Marc Forster, Vocês Ainda Não Viram Nada de Alain Resnais, As Linhas de Wellington de Valeria Sarmiento, Cosmopolis de David Cronenberg, The Grand Budapest Hotel e The French Dispatch, de Wes Anderson, Chant d’hiver de Otar Iosseliani, Até Nunca de Benoît Jacquot, Le Secret de la chambre noire de Kiyoshi Kurosawa, Les fantômes d’Ismaël de Arnaud Desplechin, Merveilles à Montfermeil de Jeanne Balibar e J’accuse – O Oficial e o Espião de Roman Polanski.
Para além de ser um dos mais prestigiados actores franceses da actualidade, Mathieu Amalric tem vindo a consolidar a sua obra como realizador. O Estádio Wimbledon (2001) é uma caminhada poética e misteriosa com Jeanne Balibar por Trieste, e La Chose publique foi apresentado em 2003 na Quinzena dos Realizadores do Festival de Cannes. Em 2010, realizou a sua quarta longa-metragem, Tournée - Em Digressão, e com ela foi galardoado com o Prémio de Melhor Realização no Festival de Cannes. Em 2014, O Quarto Azul, uma adaptação do romance de Georges Simenon, apresentado na secção Un Certain Regard do Festival de Cannes e no Festival de Cinema de Nova Iorque, valeu-lhe ainda o prémio de Melhor Realizador no Festival Mar de Plata. Em 2017, Amalric filmou Barbara, uma biografia da cantora de culto francesa, protagonizada por Jeanne Balibar. Barbara recebeu rasgados elogios da crítica e foi amplamente premiado, destacando-se o Prémio Poesia no Cinema na secção Un Certain Regard do Festival de Cannes, bem como os prémios Lumière e César de Melhor Actriz atribuídos a Jeanne Balibar. A sua oitava longa, Serre-moi fort (Cannes, 2021), pungente filme de espectros que adapta a peça Je Reviens de loin, de Claudine Galea, narra a história da partida de Camille (Vicky Krieps, numa representação poderosa, profunda e inquietante).